高效液相色谱法(HPLC)是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。

在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。

其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。

有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。

制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有上海伍丰科学仪器有限公司，上海禾工科学仪器有限公司，大连依利特公司、北京创新通恒、北京温分等。

一、输液泵

1.泵的构造和性能

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。

泵的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。

输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应小于0.5％，这关系到定性定量的准确性；②流量范围宽，分析型应在0.1～10ml／min范围内连续调，制备型应能达到100ml／min；③输出压力高，一般应能达到150～300KG/CM2：④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。

泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。

恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。

恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。

柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱压影响；泵压可达400KG/CM2。

ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。

双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1％左右，串联泵为0.2～0.3％），但出现故障的机会较多（因多了单向阀），价格也较贵。

二、进样器

一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国RHEODYNE公司的7725和7725I型最常见），其关键部件由圆形密封垫子（转子）和固定底座（定子）组成。

耐高压（35～40MPA），进样量准确，重复性好（0.5％），操作方便。

六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。

①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50％（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。

此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。

②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5～10倍9最少3倍，这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

三、色谱柱

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。

对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。

市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5～16万／米。

对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。

即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。

这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。

在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

四、检测器

HPLC的检测器分为两类：通用型检测器和专用型检测器。

1．通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化，通常采用差分测量法，这类检测器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等，通用检测器适用范围广，但由于对流动相有响应，因此易受温度变化、流动相和组分的变化的影响，噪声和漂移都比较大，灵敏度较低，不能用梯度洗脱。

2．专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。

这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。

这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、放射性检测器等。